7.  PROTEİN SENTEZİ

     Protein sentezi biyokimyasal bakımdan en karmaşık olaylardan birisidir. Bu biyosentez olayında yaklaşık olarak 300 kadar makromolekül görev yapmaktadır. Her aminoasit için en az bir tane aminoasit tRNA sentetaz enzimi ve bir tRNA bulunması gerekmektedir. Kodon tablosundaki bütün kodonların okunması için en az 32 tRNA’nın baz dizisi tayin edilmiştir. Bazı hallerde pek çok makromolekül üç boyutlu bir yapı içinde organize olmuştur. Örneğin, protein sentezi merkezi olan ribozomlar, 58 çeşit protein ve ribozomal RNA’ ların bir düzen dahilinde bir araya gelmesi ile oluşmuştur. Bunlardan başka protein sentez olayına başlama, zincir açma ve zincir sonlanma faktörleri karışmaktadır.
Protein sentezinin bu kadar karmaşık olmasına rağmen protein sentez hızı oldukça fazladır. Örneğin  E.coli ribozomlarında 100 aminoasitlik bir polipeptit zinciri 5 sn. gibi kısa bir zamanda sentezlenmektedir. Bir hücrede aynı anda birden fazla protein sentezi meydana gelmektedir. Her bir proteinin sentezinin ne zaman başlayacağı ve ne miktar sentezlenmesi gerektiği diğer moleküller tarafından kontrol edilmektedir. Hücrede sentez edilen proteinler, diğer proteinler ile de dengeli ve kontrollü bir şekilde olmaktadır.
Protein sentezini 4 safhada inceleyebiliriz :

               1)- Aminoasitlerin  Aktivasyonu

                    Her aminoaside ATP bağlanarak aktive edilir.

     Hücre sitoplazmasında bulunan 20 aminoasidin her biri kendilerine özgü olan   t – RNA’larla esterleşmektedir. Hücrede 20 aminoasidin esterleşmesini aminoaçil tRNA sentez enzimleri sağlar. Her aminoasit için en az bir tane aminoaçil  tRNA sentetaz enzimi bulunmaktadır. Aminoaçil – tRNA sentetazların aminoasitleri aktive etmek için katalizledikleri bütün reaksiyonu tek denklem halinde yukarıda gösterdik. Yine yukarıda da gösterdiğimiz gibi aslında aminoasitlerin aktivasyonu iki ayrı basamakta gerçekleştirilmektedir. Birinci basamakta ; Aminoasit karboksil grubu ile AMP’ nin 5/ ucundaki fosfata bir anhidrit bağı ile bağlanmaktadır. Bu safhada enzim aminoasit – AMP kompleksine bağlı olarak kalmakta ve bir pirofosfat ( PPi ) açığa çıkmaktadır. Bu safhada enzim, aminoasit  - AMP kompleksinden ayrılmaz ve reaksiyonun ikinci kısmını katalizler. Reaksiyonun ikinci kademesinde aminoasit AMP'nin fosfat grubundan, bu aminoasidin özgül olduğu tRNA' nın 3/ ucunda bulunan nükleotidindeki riboz şekerinin 2/ veyahut da çoğunlukla 3/–hidroksil grubuna transfer edilir. Şayet bu transfer 2’ – hidroksil grubuna yapılmışsa çabucak 3’ hidroksil grubuna aktarılır. Bu reaksiyon da yukarıda  II. Basamak olarak,gösterilmektedir.

               2) Sentezin Başlaması ( Initiation )

               Prokoryotik hücrelerde protein sentezinin başlayabilmesi için çeşitli koşulların var      olması gerekir. Bu koşulları şöyle sıralayabiliriz :

• 16S rRNA ihtiva eden ribozomun 30S subünitesi,
• Belli bir polipeptidin şifresini taşıyan  mRNA'nın var olması gerekir.
• Sentezin başlamasını sağlayacak olan N – formilmethionil – tRNA fmet olması gerekir.
• Başlama faktörleri denilen 3 protein faktörünün olması gerekir. Bu faktörler :  IF– 1  , IF– 2,   IF– 3 dür.
• Enerji ihtiyacını karşılamak için GTP' nin bulunması gerekir.

     Protein sentezinin başlayabilmesi için ilk önce sentezi başlatma kompleksinin oluşması gerekir. Sentezin başlama safhasında protein yapısında ve 3 adet; sentezi başlatma faktörleri görev almaktadır. ( I f-1, If-2, If- 3 ) Eukoryotik hücrelerdeki başlama faktörleri : eIF-1,  eIF-2, eIF –3  ayrıca, eIF –4A, 4B, 4C, 4D ve eIF-5 dir.
     Protein sentezinin başlama safhası üç basamakta gerçekleşmektedir. İlk  önce başlama faktörü  IF-3, 30S subünite ile birleşir. Bu birleşme 30S ve 50S subünitelerinin bir birine bağlanmasını engeller. Daha sonra bu yapıya IF-1 başlama faktörü katılmaktadır. Bundan sonra ribozomun başlama faktörleri olan IF-1 ve IF- 3 ile kompleks yapmış olan 30S subünitesine sentez yapılacak mRNA bağlanmaktadır.
     İkinci basamakta ise ribozomun 50S subünitesi bu yapıya katılmaktadır. Fakat 50S subünitesinin 30S, mRNA ve f Met-tRNA kompleksine bağlanması enerji gerektiren bir olaydır. Bu enerji GTP’nin hidrolize edilmesi ile ( GTP =>GDPi + 7 kcal) sağlanır. Ribozomun 50S subüniteye bağlanması ile 70S’lik fonksiyonel ribozom meydana gelir. Böylece ribozon mRNA ve fMet – tRNA'nın birbirine bağlanması ile protein sentezinin başlama kompleksi oluşmaktadır. Bu komplekse initiationkompleksi veya ternari kompleksi de denilmektedir. Burada dikkat edilmesi gereken bir nokta var : nasıl oluyor da mRNA’nın başlama kodonu olan AUG veya GUG kodonu ribozom üzerinde tam f Met – tRNA'nın bağlanacağı noktaya doğru olarak ayarlanmış oluyor. SHINE ve DALGARNO adlı iki araştırıcı 16S  rRNA'nın baz dizisini tayin ettiklerinde 3/ ucuna yakın 7 bazdan ( 3/---HO – AUUCCUCCACUA ---5) meydana gelmiş pirimidince zengin bir bölge olduğunu fark etmişlerdir. Arkasından mRNA – ribozom kompleksi pankreatik ribonükleaz ile hidrolize edildiği zaman yaklaşık olarak mRNA'nın ribozoma bağlanmış 30 nükleotitlik bir kısmının korunduğu ve diğer kısımlarının hidrolize edildiği görülmüştür. Daha sonra bu mRNA’ların baz dizisi analizleri yapıldığı zaman AUG başlama kodonunun 5 – 8 baz daha önce bir purince zengin bölgenin bulunduğu görülmüştür. 16S rRNA'nın 3/ ucunda bulunan bu pirimidince zengin bölgenin, mRNA üzerinde ve AUG başlama kodonu yakınında bulunan purince zengin bölge ile baz çiftli meydana getirdiği görülmüştür. AUG polipeptit zinciri içinde de methionin amino asidininkodonudur. Kodonlardan hangisinin başlama kodonu olduğunu 16S rRNA üzerindeki pirimidince zengin bölge tayin edebilmektedir. Bu baz dizisine shine – dalgarno dizisi adı verilmiştir.
     Protein sentezinin başlama kompleksinde fMet – tRNA bir taraftan antikodon bölgesi ile mRNA üzerindeki AUG başlama kodonuna antiparalel gelecek şekilde  (5/->3/ ) bağlanırken, diğer taraftan ribozomun ( 3/->5/ ) peptidil (P) bölgesine bağlanmış olmaktadır.

Şekil 25.   Protein sentezinin başlama safhasının ara basamakları.

          3) Zincirin uzaması ( Elangation )

          Her aminoasitin polipeptit zincirine eklenmesi ancak aminoasit sayısı ne kadar fazla ise bu safhaların tekrar etme sayısı da o kadar fazla olacaktır. Polipeptit zincirinin uzaması aşağıdaki koşulların varlığını gerektirmektedir.
     Protein sentezi başlama kompleksi gereklidir.
     m RNA üzerinde başlama kodonundan sonra gelen triplete bağlanabilecekbir aminoaçil–tRNA gerekir.
     Zincir uzamasını sağlayan ve protein yapısında olan zincir uzatma faktörleri EF– Tu  ve EF– Ts ve EF – G gereklidir. Zincir uzatma faktörleri daha basit olarak Tu, Ts, G sembolleriyle ifade edilmektedir. Zincir uzama basamağının birinci safhasında ikinci kodona bağlanacak aminoaçil - tRNA, Tu GTP kompleksine bağlanır. Bu defa yeni oluşan aminoaçil – tRN  Tu GTP kompleksi, 70S sentez başlatma kompleksinin aminoaçil bölgesine (A) bağlanır. Bu bağlanma esnasında yine enerji harcanır ve GTP hidrolize olarak Tu – GDP + Pi haline dönüşür. Ve yine 7 k cal / mol'lük bir enerji açığa çıkar. Tu–GDP, zincir uzatma faktörü Ts ve GTP ile tekrar Tu– GTP haline dönüştürülmektedir. Eukaryotik hücrelerde zincir uzatma safhasında görev alan proteinler  EF – 1*  ve EF – ß olarak adlandırılmaktadır. Zincir uzatma safhasında görev alan diğer önemli faktörlerden birisi de EF – G'dir . EF – G' nin görevini eukaryotik hücrelerde EF – 2 yapmaktadır. İkinci aminoaçil–tRNA'nın antikodon bölgesi, mRNA üzerindeki kodona antiparalel gelecek şekilde bağlanmaktadır.
     Zincir uzama basamağının ikinci safhasında iki animoasit arasında bir peptit bağı oluşturulmaktadır. Ribozomun P bölgesine bağlanmış olan fmet – tRNA methionin aminoasitinin amino (NH2) terminali formillenmiştir. Methionin aminoasidinin karboksil ucu ise 3/ – OH  grubu ile bir ester bağı yapmış durumdadır. Bu ester bağı asitlerin aktivasyon basamağında bir ATP harcanması ile yapıldığından yüksek enerjili bir bağdır. Ribozomun A bölgesine ve mRNA üzerindeki ikinci kodona bağlanmış olan  tRNA'nın 3/ OH grubuna bağlı olan aminoasitin amino (NH2) grubu serbesttir.  Ribozomun 50S subünitesinde bulunan peptidiltransferaz enzimi ikinci tRNA’ ya bağlı aminoasitin amino grubu ile birinci tRNA'ya bağlı methionun aminoasitinin arasında bir peptit bağı oluşturmaktadır. Bu peptit bağının yapılması için gerekli olan enerji f methionin aminoasiti ve tRNA arasındaki ester bağının kırılması ile kazanılmaktadır. Peptit bağı yapıldıktan sonra f Met tRNA ucundaki aminoasiti kaybettiği için artık serbest hale gelmiştir.
     Zincir uzama basamağının üçüncü safhasında ribozom, mRNA’ nın 3/ ucuna doğru bir kodon, yani üç bazlık bir mesafe kadar hareket etmektedir. Ribozomun P bölgesinde serbest kalan fmet -–tRNA sentezin ikinci defa başlatılması için bu bölgeden ayrılmakta ve serbest olarak sitoplazma içinde dolaşmaya başlamaktadır. Ribozomun mRNA üzerindeki 3/ ucuna doğru bir kodonluk bir mesafe kadar hareket etmesi başka bir zincir uzatma faktörü olan EF– G veya transkolaz tarafından başarılmaktadır. Bu hareket bir enerjiyi gerektirdiği için yine bir GTP hidrolize olmakta ve gerekli enerji bu hidroliz sonucu  ( GTP->GDP + P? + 7k.cal) sağlanmaktadır. Bu hareket esnasında ribozomun  A bölgesinde bulunan dipeptidil – tRNA ribozomun P bölgesine gelmiş olmaktadır. Ribozomun A bölgesi bir üçüncü aminoaçil–tRNA’nın bağlanması için hazır hale gelmiş durumdadır. Bu safhaya gelindikten sonra sentezlenecek polipeptidin boyu kaç aminoasitlik ise zincir uzama safhasındaki olaylar o kadar tekrar etmek zorundadır. Bu olaylar zincirinin her seferinde tekrar etmesi ile polipeptit zincirine bir aminoasit daha ilave edilmektedir.

Şekil 26 . Protein sentezinde zincir uzama safhasındaki ara basamaklar.

          4) Sentezin Sonlanması ( Termination )

     Zincir uzama safhası  mRNA tarafından belirlenen sıraya göre ve sonuncu kodona kadar devam eder. mRNA  üzerinde son aminoasitin kodonundan sonra DUR kodonlarından biri olan  UAA, UAG veya UGA kodonu gelmektedir.    Bu kodonlara zincir sonlandırma kodonları da denmektedir. Protein sentezi mRNA üzerindeki DUR kodonlarına kadar devam eder.DUR kodonuna gelindiği zaman protein yapısında olan ve RF – 1, RF – 2  ve S sembolleriyle gösterilen zincir sonlandırma faktörleri veya diğer adı ile serbest bıraktırma faktörleri işe karışmaktadır. Bu serbest bıraktırma faktörlerinden RF– 1, UAA veya UAG DUR kodonlarını, RF- 2, UAA veya UGA DUR kodonlarını tanımaktadır. Bir de RF–1 ve  RF–2 faaliyetini hızlandıran RF–3 faktörü bulunmaktadır.
     Eukaryotik hücrelerde bütün bu görevleri RF ile gösterilen tek protein yapmaktadır. Zincir sonlandırma faktörlerinin DUR kodonuna ve ribozomun A bölgesine bağlanması ribozomun 50s ünitesi üzerinde bulunan peptidil transferaz enzimini aktive etmektedir. Bu aktive edilmiş enzim ise polipeptit zincirini  tRNA'nın 3/-ucundan koparmaktadır. Zincir sonlandırma faktörlerinin peptidil transferaz enzimini nasıl aktive ettiği henüz anlaşılamamıştır. Netice olarak, bu faktörler yardımıyla son tRNA‘ya bağlı olan polipeptit zinciri tRNA‘dan koparılır ve serbest bırakılır. Ribozomun P bölgesinde bulunan 3/ – ucundan peptidi koparılan tRNA ribozomdan ayrılır. 70S yapısındaki ribozom yeniden protein sentezinde kullanılmak üzere 30S ve 50S subünitelerine ayrılır.

           
Şekil 27.  Protein sentezi DUR kodonuna gelince durur. Serbest bırakma faktörleri RF1  ve RF2 peptidil transferaza ikinci bir aktivite kazandırır, enzim polipeptidi transfer RNA' nın 3/ ucundan koparır.

Şekil 28.  Protein sentezinde, sentezin başlaması, zincirin uzaması ve zincirin sonlanması.