3.  DEOKSİRİBONUKLEİK ASİT ( DNA )

        Kalıtsal bilgilerin, sadece 4 tip monomerik üniteden oluşan, bir polimer molekülü boyunca şifrelenmiş olmasının keşfi bu polimerik molekülün DNA olduğunu göstermiştir. DNA’ nın kalıtsal bilgiler içerdiği ilk defa 1944' te Avery, Mcleod, Mc Carty tarafından bir dizi deneyle gösterilmiştir.
        Canlılığın sınırında olan virüslerden, en gelişmiş bir yaratık olan insana kadar DNA genetik maddedir. Burada canlılık olayı protein sentez bilgileri halinde saklanır, etkin hale geçirilir ve kuşaktan kuşağa aktarılır. ( Ancak bazı  RNA virüslerinde RNA’ da genetik maddedir. Bu tek veya çift iplikli olabilir. Keza DNA’da bazı virüslerde çift iplikli sarmal şeklinde olduğu gibi bazılarında da tek iplikli olabilir. )

Şekil 12.  Purin ve pirimidin bazları olan Adenin (A), Timin (T), Sitozin  (C), Guanin (G) nükleik bazlara bir N – glikozidik bağı ile tutturulmuş olduğu 2/– deoksiribozil artıkları arasındaki bir fosfodiester omurgası tarafından bir arada tutulan DNA molekülünün yapısının bir segmenti.

3.1. DNA’ nın Yapısı ve Özellikleri

3.1.1. DNA’ nın Birincil Yapısı

        DNA polimeri,fosfat gruplarıyla birbirlerine bağlanmış nukleosit birimlerinden oluşmuştur. Fosfat, bir şeker biriminin 3/ hidroksil grubu ile diğer şeker biriminin 5/ hidroksil grubu arasında bir inorganik ester bağı oluşturur. ( Şekil 12 ) Doğrusal bir DNA polimeri, bir uçta serbest bir 5/ – hidroksil grubu, diğer uçta serbest bir 3/ – hidroksil grubu içerir. Bir DNA molekülü, bir baz serisi  ( A, G, C, T ) taşıyan bir şeker – fosfat grubu omurgası içerir. Bu omurgada, bazların oluşturduğu sıraya, baz dizisi denir. Bir tekli DNA zincirinde, baz dizisini belirtmek için, birkaç kısaltılmış formül geliştirilmiştir. En basit yöntem, zincirin 5/ hidroksil ucundan başlayarak 3/- hidroksil ucuna doğru ilerleyerek; baz sırasını bazları simgeleyen büyük harfleri kullanarak belirtmektir.

3.1.2. DNA'nın İkinci Yapısı : İkili Sarmal

        Bir baz dizisi içeren DNA polimeri genetik şifreyi nasıl taşır ? 1950 yılılda J. D. Watson ve F. H. Crick, DNA' nın davranışını açıklayan bir model önermişlerdir. 1962 yılında Maurice Wilkins ile birlikte bu iki araştırmacı; X – ışınları analiziyle modelin yapısına ilişkin önemli kanıtlar elde etmişler  ve çalışmalarından dolayı nobel ödülü kazanmışlardır.

Şekil 13. DNA' nın X ışını kırılma görüntüsü.       

        Crick’ in bulduğu gibi, modelin merkezinden  X – şeklindeki çapraz yayılım bir heliksi betimlemektedir. Yukarıdaki ve aşağıdaki kuvvetli bantlaşmaların pozisyonu 3.4  Ao luk bir periyodizmi gösterir. Daha ince kalıplar, 34 Ao luk periyotların olduğu izlenimini verir.
Watson – Crick DNA modeli, iki uzun antiparalel DNA molekülünün, hidrojen bağlarıyla bir arada tutulduğu bir ikili sarmaldır. İki sarmalın uçları, bir molekülün 5/ ucu ile diğer molekülün 3/ ucundan ibarettir.
DNA zincirleri arasındaki hidrojen bağları gelişigüzel oluşmamıştır; söz konusu bağlar, belirli baz çiftlerine özgüdür; guanin sitozinle, adenin timinle hidrojen bağları oluşturmuştur.

                        Deoksitimidin                                                           Deoksiadenozin

                        Deoksisitidin                                                            Deoksiguanin

Şekil 14. Deoksiadenozin ve deoksi timidin ile deoksisitidin ve deoksiguanozin arasındaki  Watson ve Crick tarafından önerilen baz çiftlenmesi

        Timin ve adenin iki hidrojen bağıyle birbirine bağlanabilir. Sitozin ve guanin üç hidrojen bağıyla bağlanır. Dört bazın, başka şekillerde çiftlenmeleri durumunda, bu tür kuvvetli hidrojen bağları oluşamaz. ( Şekil 14 )
        DNA’nın sarmal oluşturan ve baz çiftleri arasında oluşan hidrojen bağlarıyla bir arada tutulan  iki zinciri şekil 15' te görülmektedir. Çift kollu DNA moleküllerinde, bilgiler bir kol üzerindeki nükleotitlerin sıralanmalarında yattıklarından diğer kol kalıp olmayan, yani kalıp kolu bütünleyici olarak kabul edilir.

Şekil 15.  DNA' nın çift sarmallı yapısının Watson – Crick modeli. DNA zincirleri sarmalın her tam dönüşünde, 10 baz çift bulunacak şekilde birbirlerine sarılarak bir ikili sarmal oluşturmuşlardır.

3.2.   DNA' nın Denaturasyonu ve Renatürasyonu

        Polinukleotitler arasındaki fosfodiester bağı kopmadan bazlar arasındaki hidrojen bağlarının kırılması ve iki sarmalın birbirinden ayrılması olayına DNA' nın denaturasyonu  denmektedir.

Şekil 16. Sıcaklığın artması ve olayların sağa doğru ilerlemesi ile DNA molekülü denature olmaktadır. Eğer olaylar sola doğru ilerleyecek olursa DNA molekülü renatüre olmaktadır.

        DNA, pH değişmesi, sıcaklığın artması ve bazı reaktifler ile deneturasyona uğrayabilir. Kuvvetli asitler ya da bazlar, DNA yapısında bulunan nötr heterosiklik bazların iyonik yükler kazanmasına yol açar. Bu yükler, etkin hidrojen bağı oluşumu için gerekli olan bazlığı etkiler.

        Bir DNA molekülünün Tm ( DNA çift sarmalının % 50’ sini tek sarmal haline getiren sıcaklığa erime noktası “ melting temperature” denir ve Tm ile gösterilir ) derecesinin yüksek olması o DNA molekülünde G – C baz çiftinin yüksek olduğunu göstermektedir. Çünkü guanin – sitozin (G-C) arasında üç hidrojen bağı bulunmaktadır. Halbuki adenin – timin (A-T) arasında iki hidrojen bağı bulunmaktadır. Guanin – Sitozin arasindaki üç hidrojen bağını (G-C) kırmak için daha fazla enerji yani daha yüksek sıcaklık derecesi gerekmektedir. Bu nedenle, eğer bir DNA molekülünde G – C baz çifti oranı yüksekse  o DNA molekülünün erime noktası yani Tm derecesi de yüksek olmaktadır.
        DNA' nın ısıtılması ve yüksek veya düşük pH derecelerine tabi tutulması ile, ilk önce adenin – timin ( A – T ) baz çiftlerinin sıklıkla bulunduğu bölgelerin bir birinden ayrıldığı görülmektedir.
        Isıtılan ve bir birinden ayrılan DNA tek  sarmalları kendi haline bırakılacak olursa çift sarmallı DNA yeniden meydana gelmektedir. Bu olaya ANNEALING adı verilmektedir. Çift sarmallı hale dönüşen DNA molekülü de tekrar eski biyolojik fonksiyonunu kazanmaktadır.
        Eğer DNA molekülü kısmen denature olmuş ise renatunasyonu daha kolaydır. Şayet denaturasyon tam olmuş ve zincirler bir birinden tamamen ayrılmış ise renaturasyon daha uzun bir süre gerektirmekte ve daha zor  olmaktadır.
        Renaturasyon hızı, derişim yanında, DNA' nın karmaşıklığına da bağlıdır.

3.3.  DNA'nın Çeşitli Formları :

        DNA çift sarmalı için ileri sürülen orjinal model sağ el heliks yapısı göstermektedir.
DNA' daki sağ el heliks yapısı sterokimyasal konfigurasyon bakımından sol el heliks yapısından daha kararlı bir yapı şeklidir. DNA' ların büyük bir kısmının sağ el heliks yapısı göstermesi bu duruma bir kanıt olarak gösterilebilir.
        Klasik Watson – Crick çift sarmal modeli sağ el heliks yapısı gerektirmekte ve çift zincirin bir tam dönüşünde ise yapıya 10 baz girmektedir. Baz çiftleri çift sarmal eksenine dikey olarak yer almış bulunmaktadır. Bu yapıdaki DNA’ ya B – DNA adı verilmektedir.

Şekil 17.  Sağ el heliks yapısı gösteren DNA molekülünün üç boyutlu yapısı. Çift sarmal yapı ve bu yapı içerisinde bazların karşılıklı dizilişleri

Şekil 18. A ve B formlarındaki DNA 'ların çift sarmalı şeker ve fosfatın biribirine bağlanması ile meydana gelmektedir.
İki sarmal arasındaki çizgiler ise baz çiftlerini ifade  etmektedir.

        Eğer sağ el çift sarmal yapı gösteren DNA molekülünün bir tam dönüş yapması için yapıya 11 baz girmiş ve baz çiftleri çift sarmal eksenine  20o’lik bir açıyla yerleşmiş bulunuyorsa ve DNA molekülü su kaybetmişse bu yapıdaki DNA’ya A – DNA adı verilmektedir.
        DNA yalnız yüksek tuz konsantrasyonunda sol el heliks yapısı göstererek  Z – DNA şeklinde bulunmaktadır.  Z – DNA' nın bir tam dönüşünde yapıya 12 baz girmektedir.
        Şayet Z- DNA düşük tuz konsantrasyonu ihtiva eden bir ortama nakledilecek olursa sağ el heliks yapısını alıp B – DNA şekline dönüşmektedir.

Şekil  19.  Z ve B forumlarındaki DNA 'ların üç boyutlu yapı modeli.  Z formundaki
DNA 'nın yapısında gösterilen  kırık çizgiler fosfat bağlarını ifade etmektedir.

3.4.  DNA Molekülünün Baz dizisinin Tayini

        Bunun için DNA molekülleri önce restriksiyon endonükleazlar ile küçük frangmentlere ayrılmaktadır. Daha sonra çift sarmallı DNA’nın iki sarmalının bir birinden ayrılması ve tek sarmallı DNA haline dönüşmesi lazımdır. Bunun için DNA molekülü ısıtılarak tamamen denatüre edilir. Ve sarmalların birbirinden ayrılması sağlanır. Arkasından jel elektroforezi uygulanarak bu zincirin elektroforetik  alandaki hareket hızı birbirinden farklı olduğundan zincirlerin bir birinden ayrılması sağlanır. Sonra meydana gelen iki bant, jelden kesilir ve DNA tek sarmalları tekrar jelden koparılır.
        Elimizde aşağıda gösterildiği gibi 10 baz dizisinden oluşan bir DNA fragmenti olduğunu düşünelim.
                                5’ – G – A – T – C – A – G – C – T – A – G – 3’
        Böyle bir fragmentin  5’.... ucundaki fosfat grubunun hidroksiline, genellikle polinukleotit kinaz enzimi aracılığı ile radyoaktif  32p ( Radyoaktif fosfat 32 ) ilave edilir. Böylece DNA fragmenti 5'... ucundan 32 p ile işaretlenmiş olur.
                                5/... 32 p  G – A – T – C – A – G – C – T – A – G -  3/
        Bu safhadan sonra dört ayrı kimyasal reaksiyon kullanılarak 10 bazlık  DNA fragmentinin baz dizisi tayin edilmiş olur.
        Diğer bir yöntem Sanger ve Coulson tarafından geliştirilmiştir. Baz dizisi tayin edilecek olan DNA yine tek sarmallı hale getirilmelidir. Baz dizisi bilinmeyen bir DNA parçası alınır. Ortama d  TP,  d CTP,  d GTP  ve dd ATP ilave edilir ve DNA polimeraz 1 ile bu DNA zincirinin komplementert sentez edilir. Fakat adenin yapıya girdiği üç noktadan sonra fosfodiester bağı yapılamadığından üç farklı uzunlukta zincir sentezlenir. Diğer ddNTP’lar da kullanılarak sentez tekrarlanır. Ve her bazın bulunduğu pozisyon jel elektroforezinden sonra tayin edilir.